豬日本乙型腦炎病毒熒光定量RT-PCR試劑盒

產(chǎn)品名稱：豬日本乙型腦炎病毒熒光定量RT-PCR試劑盒

英文名稱：Epidemic Encephalitis B SYBR qRT-PCR Kit

乙型腦炎病毒(Epidemic Encephalitis B)是一種 RNA 病毒，也是豬日本乙型腦炎（流行性乙型腦炎）的病原體，在低溫條件下，該病毒能自下而上較長時間，在動物、雞胚及組織培養(yǎng)細(xì)胞中均能增殖。幼豬是乙腦病毒的主要傳染源和中間宿主，蚊子是乙腦  病毒的傳播媒介。當(dāng)人受帶病毒的蚊子叮咬后，乙腦病毒進(jìn)入人體，在血管內(nèi)皮  細(xì)胞、淋巴結(jié)、肝、脾等吞噬細(xì)胞內(nèi)增殖，并經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)腦部而引起炎癥， 因此乙型腦炎病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用。本產(chǎn)品基于 PCR 原理開發(fā)。它具有下列特點：

1. 一站式，用于不需要單獨準(zhǔn)備每種成分，包括引物和對照。

2. 根據(jù)乙型腦炎病毒的保守基因序列設(shè)計的引物，具有良好的特異性。

3. 基于染料法 qRT-PCR 檢測，靈敏度比常規(guī) RT-PCR 高 10-100 倍，可以達(dá)到至少 1000 拷貝/反應(yīng)。

4. 使用一管式 qRT-PCR 技術(shù)，RT 和 PCR 兩步在一個試管內(nèi)完成，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。

5.本產(chǎn)品足夠 50 次 30μL 體系的 RT-PCR，只能用于科研，不能用于臨床。

【試劑組成】

【自備試劑】樣品 RNA

【注意事項】

一、稀釋陽性對照（以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原。

1.標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

2.在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

3.換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

4.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

二、樣品 RNA 的制備

5.如果有 N 個樣品，必須設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第 4 號（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬拷貝）再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ?。

6.用自選方法純化 N+2 個樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA/提取試劑盒兼容。本試劑盒免費贈送1ml免 RNA 提取的核酸釋放劑，其使用手冊可以向本公司客服索取。

三、設(shè)置 RT-PCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

7.如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號陽性對照稀釋液做模板）。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把 6 個標(biāo)曲反應(yīng)縮減成 1 個，其余不變。

8.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后最后加）：

注:需使用 ROX 染料 I 的機型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。

需使用 ROX 染料 II 的機型：：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research 的 Chromo4、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。

不 需 要 使 用 ROX 的 機 型 ： Thermal Cycle Dice Real Time System ， LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000。

9.  上機后按下面參數(shù)進(jìn)行 RT-PCR（參數(shù)可能會因儀器不同而需優(yōu)化）。

四、數(shù)據(jù)處理

10.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。